U ovom tekstu biće predstavljeno PGS testiranje (nazvano PGT-A) u IVF-u radi skrininga embriona. Naučićemo nešto o hromozomskoj aneuploidiji i euploidnim embrionima, kako PGS funkcioniše, kako čitati rezultate ispitivanja PGS-a, o stopi uspeha PGS-a, mozaicima i svim kontroverzama koje s vezuju za PGT!
Mnoštvo dokaza ovde, a ponekad i studije mogu da se suprotstavljaju jedan drugom. To je zato što ljudi imaju veoma složenu biologiju, pa se nemojte iznenaditi ako ovi rezultati ne odgovaraju vašem iskustvu. IVF najbolje funkcioniše kada je personalizovan, pa je zato najbolje mesto da pitate o vašoj konkretnoj situaciji upravo vaša IVF klinika! Oni će razumeti pozadinu vaše priče, dijagnozu i imaće kompletan uvid u situaciju.
Definicija
Preimplantacijsko genetsko testiranje (PGT) je opšti termin za testiranje DNK embriona. Postoji nekoliko verzija PGT-a:
- PGT-A = PGT za aneuploidiju (PGS ili CCS)
- PGT-M = PGT za monogene / pojedinačne defekte gena (PGD)
- PGT-SR = PGT za strukturno preuređivanje
U ovom postu će se uglavnom govoriti o PGS / PGT-A, sa korišćenjem imena “PGS” jer je to termin koji je najviše poznat.
Šta je hromozomska aneuplodija?
Osnovna ideja iza PGS-a je da embrioni koji imaju tačan broj hromozoma (euploid) imaju bolji uspeh od embriona sa pogrešnim brojem hromozoma (aneuploid).
Skoro svaka ćelija u našem telu ima DNK i u najvećem delu je to samo komadić koji je deo “hrpe”. Kada se ćelija podeli da bi se sama kopirala, ona organizuje ovu hrpu DNK (nazvan „hromatin“ – izgleda kao gomila špageta) u hromozome. To se događa zato što je lakše napraviti kopije DNK na ovaj način.
Imamo 46 hromozoma – 23 potiču iz jajne ćelije, a 23 iz spermatozoida. 22 od njih su „autosomi“ (# 1-22), a 2 su seksualni hromozomi (X i Y). Dakle, postoje 24 različita hromozoma koji sadrže sve informacije za život.
Polni hromozom određuje pol. Devojčica ima dve kopije X hromozoma, a dečak kopiju X i kopiju Y hromozoma.
Kompletan set hromozoma, svaki numerisan, uključujući polne hromozome X i Y.
Svaki je par, a jedan dolazi iz jajne ćelije, a jedan iz spermatozoida. Hromozomska aneuploidija je kada postoji bilo koji drugačiji broj od 46. Dakle, ako imate 45 ili 49, onda je to aneuploid. Embrion sa 46 hromozoma ima tačan broj i to je euploid.
Kada je vaš embrion aneuploidan, postoji veća mogućnost da se dogodi pobačaji ili se ne implantira.
Šta uzrokuje hromozomsku aneuploidiju?
Mnogo stvari koje na kraju ukazuju na kvalitet jajnih ćelija ili kvalitet spermatozoida. Jajne ćelije imaju veću verovatnoću da će biti aneuploidne s godinama starosti žene. Dakle, embrioni dobijeni od starijih jajnih ćelija imaju istu sudbinu – da budu aneuploidni.
Dakle, za žene koje imaju ponovljene pobačaje (više od 2) ili za žene starije od 35 godina, screening embriona sa PGS / PGT-A testom može pomoći.
Istorija PGS testiranja
Istorija PGS-a započinje idejom da je hromozomska aneuploidija glavni razlog zbog čega embrioni ne uspevaju da se implantiraju ili dolazi do pobačaja. Kada odredimo koji su embrioni euploidni, trebalo bi da imamo bolju priliku za odabir pravog embriona za transfer.
PGS 1.0 (prva generacija)
Devedesetih godina prošlog veka postojala je FISH – fluorescentna in situ hibridizacija – ali na ovaj način je bilo moguće samo pregledati nekoliko od 23 hromozoma i uglavnom je rađena na embrionu u fazi podele.
Sledećih 20 godina i više, FISH je bio osnovna metoda ispitivanja, ali ipak nije bila baš uspešna ova metoda u predviđanju ishoda trudnoće. Zapravo, neke studije su pokazale da su testiranja imala lošije rezultate u odnosu na neproverene. Tako je PGS testiranje obeshrabreno.
PGS 2.0 (druga generacija)
Praćenje embriona do blastociste postao je sve popularnija 2000-ih godina, a preimplantacijsko genetičko testiranje počelo je uzimati u obzir trofektodermu u blastocisti za biopsiju. Sama tehnologija se takođe poboljšala i sada su svi hromozomi mogli da se analiziraju umesto samo nekoliko pomoću FISH-a.
Ove tehnike su bile dobre za svoje vreme, ali ljudi koji su prebacivali euploidne embrione imali su pobačaje, koji su kasnije testirani kao aneuploid.
Izražena je sumnja zbog PGS testiranja, a zabrinutost zbog lažno pozitivnog rezultata postaje problem jer se embrioni sa dobrim potencijalom mogu odbaciti.
PGS 3.0 (treća generacija)
Sredinom 2010. godine počeli smo da shvatamo da blastociste možda nisu 100% euploidne ili aneuploidne, i da mogu biti mešavina ovih ćelija. To je poznato kao embrionski mozaicizam i može objasniti zašto embrioni testirani kao euploid mogu propasti i ponovo se testirati kao aneuploid.
Sa poboljšanom tehnologijom (NGS), sada smo u stanju da otkrijemo mozaicizam. Ovo je pokrenuto u PGS 3.0/PGT-A (PGS je u ovom trenutku re-brendiran kao PGT-A).
Da li mi treba PGS testiranje?
PGS/PGT-A testiranje se obično preporučuje za:
- Žene preko 35 godina ili sa ponavljajućim pobačajem
- Žene s višestrukim neuspelim ciklusima IVF-a
Kako napreduje starosna dob, aneuploidija je češća i može dovesti do više pobačaja. Pregled embriona može poboljšati stopu uspeha.
Loše prognoze žena koje ne mogu da dobiju blastociste ili blastociste dovoljnog kvaliteta za biopsiju neće imati koristi – pitajte svoju kliniku koji je kvalitet embriona potreban za biopsiju i koji procenat žena tog doba dobija blastocistu tog kvaliteta.
Troškove testiranja PGS/PGT-A (i troškove potencijalno više ciklusa da bi se dobili euploidni embrioni) potrebno je odmeriti bez testiranja i potencijalno više transfera / pobačaja korišćenjem neproveranih embriona.
CENA SA PGS:
– naknada IVF klinici za proceduru
– naknada za PGS
– ponovno testiranje ako nema rezultata
– više IVF procedura ukoliko nema euploidija
– uspeh je kontroverzan
CENA BEZ PGS-A:
– potencijalno više transfera
– potencijalno više pobačaja
Kako funkcioniše PGS testiranje?
Biopsija embriona: Prvi korak je dobijanje ćelija iz embriona za testiranje.
Ovih dana skoro svi koriste ćelije trofektoderme iz blastociste. Koraci za biopsiju embriona su:
- Na zonu embriona 3. dana laserom se izvodi malena rupa (asistirani hečing)
- Od 5. do 7. dana (varira) ćelije embriona izlaze iz ove rupe
- Ćelije koje izbijaju sukcioniraju se i razdvajaju laserom
- Ovaj biopsirani komad se čuva u zamrzivaču, a zatim šalje u drugu laboratoriju na PGS testiranje
- Biopsirani embrion se zamrzava dok se ne dobiju rezultati i ne uspostavi transfer embriona
Vidite taj sićušni komad? Ovo je komad koji je PGS testiran. Pretpostavljamo da ostatak embriona ima istu “šminku”. Koliko se poklapa sa ostatkom embriona je sporno.
Razumevanje rezultata PGS testiranja
Vrste hromozomskih poremećaja: Postoje razne hromozomske nepravilnosti koje se mogu javiti u aneuploidiji:
- Monosomija je brisanje celog hromozoma
- Trisomija je umnožavanje / dodavanje celog hromozoma
- Brisanje / dodavanje segmenta utieče na samo segment hromozoma
Zatim pogledajmo kako bi izgledali stvarni rezultati zajedno sa širenjem hromozoma radi vizualizacije koncepta.
Evo primera euploidnog embriona:
Aneuploidni embrion koji ima monosomiju 22:
Aneuploidni embrion koji ima monosomiju 22 i trisomiju 10:
„Segmentalni aneuploid“ ima samo deo na koji je hromozom zahvaćen, na primer „dup (16) (k23.2-kter)“
- dup (16) znači da postoji umnožavanje na hromozomu 16
- (k23.2-kter) znači da je ovo umnožavanje za k23.2-kter region
Svaki hromozom ima kratku ruku (“p”) i dugu ruku (“k”), koja se dalje može podeliti u pojaseve (poput k23.2).
Za k23.2-kter na hromozomu 16, taj sitni komad je na kraju:
A evo kako bi to izgledalo (primetite duplikaciju u zelenom okviru za hromozom 16):
Razumevanje mozaika, složenih abnormalnosti, haotičan ili nikakav rezultat
Za mozaike možete videti nešto poput „mos [+2]“ – to znači da su neke ćelije u biopsiji imale trisomiju 2. Laboratorija za ispitivanje PGS može ili ne mora dati procenat mozaizma.
Moglo bi se složiti sa mozaicima, poput „+2, mos [-1]“, to znači da sve ćelije u biopsiji imaju trisomiju 2, a samo neke imaju monosomiju 1 (tako da su mozaik za monosomiju 1 ).
Ostale važne informacije:
Složena abnormalnost je ona koja ima 3 ili više hromozomskih nepravilnosti. Haotična abnormalnost ima veliki broj abnormalnosti koje otežavaju interpretaciju. Neuporediv / nema rezultata znači da uzorak nije dovoljan za PGS testiranje ili da ispunjava standarde kontrole kvaliteta za analizu.
Za neupadljive rezultate, studija Cimadomo et al. (2018.) pokazala je da otpada oko 1,5-5% vremena i da zavisi od tehničkih sposobnosti klinike za IVF. Ponekad se uzorak ne učita pravilno, a epruveta je prazna (uzorak je vrlo mali, pa se uzorak degradira).
3. ili 5. dan embriona za PGS testiranje?
U ranijem periodu 3. dan (faza podele) biopsije embriona bile su češće. Ovih dana smatraju ih inferiornim biopsijama iz 5. dana (trofektoderma) iz nekoliko razloga:
- Smanjena stopa održivosti i implantacije pomoću 3. biopsije 3. i 5. dana (Scott et al. 2013).
- Ocenjivanje trećeg dana se ne podudara dobro sa euploidijom poput embriona petog dana (Majumdar et al. 2017).
- Viši mozaicizam i embrioni mogu se samoispraviti i postati normalni do 5. dana (Barbash-Hazan i dr. 2009).
Jedna od prednosti je da se embrioni mogu biopsirati na 3. dan, a rezultati se mogu vratiti na vreme za novi transfer 5. dana. Međutim, negativni nadmašuju taj pozitivni rezultat i biopsija 5. dana (trofektoderma) sada je norma.
Stope uspešnosti PGS testiranja
Šanse za dobijanje euploidnog embriona?
To varira u zavisnosti od starosti. Velikim istraživanjem ustanovljeno je da za žene ispod 35 godina postoji oko 60% šanse da blastocista bude euploidna (30% od 41). Mogućnost dobijanja NO euploida bila je oko 10% za <35 i oko 50% za 43.
Stope uspeha za euploide
Ispod su dati podaci oko 650 euploidnih transfera. Imajte na umu da je to po podacima o transferu. Mnoge od ovih stopa su smanjene kada su pogledali podatke o preuzimanju, koji uključuju žene sa otkazanim transferima zbog nepostojanja euploida.
- <35: 66% živorođeno po transferu
- 35-37: 71%
- 38-40: 60%
- 41-42: 72%
- > 42: 52%
- Donarska jajna ćelija: 65%
Da li je stadijum embriona, ili dan kada su bili zamrznuti, važan?
Nekoliko studija proučavalo je stadijume embriona i otkrilo da oni utiču na uspeh euploida. Embrioni visokog kvaliteta su bolji od embriona slabijeg kvaliteta. Onaj dan kada je embrion bio zamrznut (5., 6., 7. dan) takođe igra ulogu.
Da li re-biopsija ili odmrzavanje i biopsija utiču na stopu uspeha?
Neke manje studije su urađene. Re-biopsija može imati uticaja (kod 1 od 3 pronađeno je smanjenje, kod ostalih 2 nema razlike ili nije značajno), kao i odmrzavanja i biopsija (2 studije, jedna nije značajna). Definitivno je potrebno još istraživanja!
Mozaični embrion
Mozaični embrioni su relativno nova ideja. Euploidni embrioni imaju sve normalne ćelije, a aneuploidni embrioni sve nenormalne ćelije. Mozaik je miks.
Mozaični embrioni su otkriveni upotrebom osetljivije tehnologije testiranja PGS-a. Klinike ih prenose nesigurno, pogotovo kada neke ćelije imaju trizomiju 21, na primer!
Utvrđene smernice i rangirane mozaične trisomije:
- Veoma nizak rizik od održive aneuploidije: Trisomije 1, 3, 10, 12, 19
- Nizak rizik od pobačaja, održiva aneuploidija: 4, 5, (47, XXY)
- Veći rizik od pobačaja, nizak rizik za UPD: 2, 7, 11, 17, 22
- Rizik od pobačaja, UPD, održiva aneuploidija: 6, 9, 15
- Visok rizik za uključivanje fetusa: 8, 20, (47, XXX), (47, XXY)
- Visok rizik za održivu aneuploidiju: 13, 14, 16, 18, 21, (45, X)
Mozaični embrioni mogu se samoispraviti, to je proces u kojem euploidne ćelije preplave aneuploidne ćelije kako bi stvorili zdravu bebu. Kako se to događa nije jasno.
Generalno, mozaici imaju manji uspeh u odnosu na euploide:
- 40% (mozaik) vs 63% (euploid) u toku trudnoće
- 25% vs 10% pobačaja
- 30% vs 47% implantacija
Vrsta abnormalnosti (tj. Mozaik celog/segmenta /%) takođe može diktirati stope uspeha.
Transferi mozaika su sekundarni u odnosu na euploid i trebalo bi ih proceniti u dogovoru sa lekarom dok ne saznamo više o njima.
PGS Testiranje – kontroverze
Da li PGS / PGT-A testiranje funkcioniše?
Verovali ili ne, uspeh PGS/PGT-A testiranja je kontroverzan!
PGS testiranje pokušava da postigne:
- Veću stopa trudnoće/živorođenih
- Niže stope pobačaja (odabirom kompetentnih embriona).
Da li su stope uspeha veće sa PGS testiranjem?
Veliki RCT (> 600 transfera) 2019. imao je za cilj da sagleda koliko je ranije ocenjivanje embriona, u poređenju sa PGS testiranjem, u kontekstu dobre prognoze.
- Za 25-34 godine: nema razlike u trajnoj stopi trudnoće (49,3% sa PGS vs 53,0% bez)
- Za 35-40: povećanje stope trudnoće u toku (50,8% sa PGS u odnosu na 37,2% bez)
- Nema razlike u stopama pobačaja u obe grupe
U jednoj studiji, 42% u poređenju sa 69% u toku trudnoće (bez PGS u odnosu na PGS, pojedinačni embrion)
U drugom istraživanju, 48% u odnosu na 66% u toku trudnoće (bez PGS-a protiv PGS-a, uglavnom jednog embriona)
Dakle, u ovim studijama, PGS testiranje je poboljšalo stope! Kritika je bila da su ove studije male (<100 pacijenata) i da su koristili samo dobru prognozu (<35, > 16 oocita pronađenih po ciklusu, > 5 embriona biopsiranih).
Budući da se aneuploidija povećava sa godinama, očekivali bismo da će starije žene imati više koristi od mlađih žena.
Poređenje transfera euploida i neproverenih embriona:
- Za <37, nisu našli razlike u stopi živorođenih (~ 50%) – uporedili su to sa prethodnim studijama koje su otkrile razlike = kontroverzno !!
- Za > 37, živorođenje se povećavalo pri prenošenju euploida (58% prema 18%) – po prenosu
- Kada se gledaju statistike „po primanju“, živorođenje se smanjilo sa euploidima (20% prema 40%)
Ova poenta o podacima „po primanju“ ima smisla – neće sve žene imati podobne embrione koji će biti biopsirani, a ni svi biopsirani embrioni neće biti euploidni. Dakle, stope bi prirodno bile niže. Utvrđeno je i su da su stope nataliteta po transferu i po pacijentu (slične potražnji) veće u grupi sa PGS kod žena 38-41.
Kod žena 35-40 godina, trudnice su u toku procedure bile 51% za euploide, a 37% za neproverene u RCT-u koristeći NGS.
Na osnovu ovih podataka, izgleda da PGS testiranje deluje, posebno za žene >35 – kada imate euploide za transfer!
Da li je broj pobačaja niži kod PGS testiranja?
Veliko istraživanje (> 600 prenosa) nije našlo razliku u stopama pobačaja kod korišćenja neproverenih i testiranih embriona kod pacijentkinja sa dobrom prognozom.
Evo nekoliko studija:
- PGS testirani embrioni doveli su do 2,6% do 31,6% stope pobačaja
- Neke studije nisu našle razliku između testiranog i neproverenog
- U drugim studijama je utvrđeno da PGS testiranje smanjuje pobačaj
Sadašnji podaci ukazuju da PGS / PGT-A testiranja smanjuju pobačaje, dok postoje i podaci koji ukazuju da ne utiče. Dakle, na osnovu ovih podataka sporno je da li PGS smanjuje pobačaj ili ne.
Veličina uzorka i slaganje
Rezultati biopsije embriona nisu 100% uverljivi. Mali uzorak (oko 5-10 ćelija) je obično biopsiran iz embriona koji ima potencijalno stotine ćelija. Pa koliko možemo biti sigurni da su rezultati reprezentativni za ceo embrion?
Evo kako biopsija jednog mozaičnog embriona može imati 3 različita rezultata:
Samo prvi rezultat je tačan. Druga dva rezultata su netačni, ali dijagnoza će biti euploidna ili aneuploidna. Dakle, i ako rešite da uradite transfer, i ako ne rešite, ne možete biti sigurni da li je embrion ovakav ili onakav.
Koliko ćelija je potrebno za biopsiju radi tačnih rezultata?
Matematičkim proračunom otkriveno je da će trebati 27 ćelija da bi se pouzdano utvrdio status embriona (iz trofektoderme od 300 ćelija).
Koliko dobro biopsija trofektoderme odgovara ICM?
Pošto je ICM ono što čini plod, a biopsija je iz trofektoderme (TE), ovo je veliko pitanje! Jedna od studija pokazala je da od 19 embriona koji su bili aneuploidni za TE, ICM takođe bio aneuploid. Drugom studijom dobijeni su rezultati NGS testa sa POC pobačaja (kao pokazatelj ICM-a) i ustanovljeno da se 14 od 20 podudara.
Da li se re-biopsije istog embriona podudaraju?
Re-biopsijom 37 abnormalnih embriona (analiziranih različitim tehnologijama) generalno je pronađeno loše podudaranje:
- 27 od aCGH, a zatim NGS: 3/27 se podudara, 9/27 je potvrđeno kao euploid, ostatak je imao različite pogođene hromozome.
- 6 prema SNP-u, zatim NGS: 3/6 se podudara, 1/6 je ponovljeno kao euploid, ostatak je imao različite pogođene hromozome.
- 3 sa aCGH, a zatim SNP: 0/3 je podudarno, 3/3 je ponovljeno kao euploid.
Ovo su veoma ozbiljni dokazi! Potrebno je još studija.
“Abnormalni” embrioni
PGS testiranje prešlo je dug put u prijavljivanju mozaicizma.
Starija tehnologija poput aCGH nije bila tako osetljiva kao trenutna tehnologija (NGS) i mogla je otkriti samo mozaik između 40-60%. Za NGS, to je između 20-80% mozaika :
- Za aCGH, <40% mozaik = euploid i> 60% mozaik = abnormalno.
- Za NGS, <20% mozaik = euploid i> 80% mozaik = abnormalno.
Kod aCGH, 20% mozaika je bio euploidano i transfer se radi bez problema. Ali kod NGS-a, 20% mozaika je mozaik, a neće svi raditi transfer takvih embriona (međutim, s novim istraživanjima ovo će se verovatno promeniti).
I “abnormalni” embrioni koji su zapravo 60-80% mozaik aCGH? Oni nisu prebačeni – ili eventualno odbačeni – jer su označeni aneuploidom zbog ograničenja tadašnje tehnologije. Neke klinike mogu biti otvorene za transfer mozaika visokog nivoa, ali vrlo malo (ako ih ima) će prebaciti embrione testirane kao aneuploidne.
Kako vreme prolazi, poboljšaće se samo tehnologija. Šta će nam reći sledeća faza tehnologije? I nakon toga? Hoće li biti dana u kojem nema euploidnih ili abnormalnih embriona, već samo nijanse mozaika?
Ili će se mozaici zanemariti i prepoznati kao privremen i normalan deo razvoja embriona? U svakom slučaju, verovatno je najbolje da se “drže” abnormalnih embriona – za svaki slučaj!
Ukoliko imate bilo koje pitanje možete kontaktirati Centar za vantelesnu oplodnju na 0800 333 030 ili direktno Udruženje Šansa za roditeljstvo na 061/624-5224.
Izvor: www.rembryo.com
